ChemNet
 
Вестник Московского Университета, серия "Химия"
Предыдущая статья Следующая статья Содержание  

А.Ю. Христиченко, А.А. Полозников, Д.М. Хушпульян, Н.А. Смирнова, А.А. Захарянц, С.В. Казаков, В.И. Тишков, И.Г. Газарян

Количественный анализ действия клеточных репортеров на основе фьюжен-белков люциферазы

Реферат

Клеточные репортеры на основе экспрессии слитых белков люциферазы с доменами траскрипционных факторов, ответственных за их стабильность, представляют собой микробиореакторы, позволяющие напрямую следить за судьбой транскрипционного фактора (или его домена), меченного люциферазой, в реальном времени. Для понимания принципиальных возможностей и ограничений данных систем при использовании в прикладных и фундаментальных исследованиях необходима разработка количественного описания их действия, которая предполагает расчет/измерение действующей внутриклеточной концентрации слитых белков и скорость их наработки. В данной работе на основе экспериментальных данных рассчитана внутриклеточная концентрация фьюжен-белков люциферазы в стационарном состоянии в линиях нейробластомы SH-SY5Y, стабильно экспрессирующих слитые белки-репортеры HIF1 ODD-luc и Neh2-luc, методом калибрования по люциферазной активности. Показано, что в обоих случаях концентрация слитых белков люциферазы составляет порядка 6080 нМ, что близко к значениям как константы Михаэлиса (10100 нМ HIF) для HIF пролил гидроксилазы, так и константы диссоциации комплекса Keap1Nrf2 (50 нМ) (параметров, контролирующих скорость-лимитирующие стадии действия репортеров HIF1 ODD-luc и Neh2-luc соответственно). Новые данные дают возможность оценить скорость наработки и максимально достижимую концентрацию фьюжен-белков в условиях их стабилизации. Это позволяет предложить количественную схему действия репортера Neh2-luc для объяснения значительного сдвига кажущихся параметров активации по сравнению с истинными константами диссоциации, определяемыми для известных активаторов "вытеснения" в гомогенном анализе методом поляризации флуоресценции с использованием рекомбинантного Keap1 и меченого Nrf2 пептида.
Ключевые слова: Nrf2, Keap1, HIF пролилгидроксилаза, бардоксолон, андрографолид, активаторы вытеснения.

  Полный текст статьи в формате PDF

Вестник Московского Университета.
Химия 2019, том 60, № 4, стр. 240-247


Copyright (C) Химический факультет МГУ, 2019


Сервер создается при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований
Не разрешается  копирование материалов и размещение на других Web-сайтах
Вебдизайн: Copyright (C) И. Миняйлова и В. Миняйлов
Copyright (C) Химический факультет МГУ
Написать письмо редактору